海關總署:多次檢出禁用藥物暫停臺灣石斑魚輸入，水產品中孔雀石綠和結晶紫如何測定？

海關總署：暫停臺灣石斑魚輸往大陸

去年以來，大陸海關多次從臺灣地區輸大陸石斑魚中檢出孔雀石綠、結晶紫禁用藥物，還檢出土霉素超標。

為防范風險，保護消費者身體健康和生命安全，依據大陸相關法律法規和標準，海關總署決定自2022年6月13日起暫停臺灣地區石斑魚輸入大陸。

水產品中孔雀石綠和結晶紫

孔雀石綠是有毒的三苯甲烷類化合物，既是染料，也是殺真菌、殺細菌、殺寄生蟲的藥物，長期超量使用可致癌，無公害水產養殖領域國家明令禁止添加卻屢禁不止。

孔雀石綠的檢測可參照國標《GB19857-2005水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留的測定》和《GB20361-2006水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留的測定高效液相色譜熒光檢測法》。其中GB19857-2005采用液質方法對孔雀石綠和結晶紫含量分別進行測定，加入內標進行內標矯正。GB20361-2006法中加入硼氫化鉀將孔雀石綠和結晶紫的活潑雙鍵還原，分別形成隱形孔雀石綠和隱性結晶紫，最后再以熒光檢測二者的總量。孔雀石綠結構中的雙鍵屬于活潑的反應位點，常常容易發生氧化或者去甲基化，導致測試孔雀石綠比較困難。

圖-1. 孔雀石綠和結晶紫的結構式及相互轉化

本方法參考了上述方案的兩種國標的前處理過程，采用不加入還原劑對樣品進行前處理，加入內標物質后采用中性氧化鋁固相萃取柱凈化目標物，洗脫目標物后濃縮經液相色譜-質譜/質譜聯用檢測4種目標化合物。

儀器與耗材

1.儀器

睿科Fotector Plus高通量全自動固相萃取儀

睿科AP 300 全自動液體樣品處理工作站

睿科AH 50全自動均質器

睿科Auto EVA 80 高通量全自動平行濃縮儀

高效液相色譜 (HPLC) Agilent 1260

質譜檢測器 (MS) Agilent 6410

2.耗材

中性氧化鋁固相萃取柱 (1g/3 mL)

3.試劑

甲醇（HPLC）；乙腈（HPLC）；水；5 mmol/L乙酸銨緩沖溶液：稱取0.385g 無水乙酸銨溶解于1000mL 水中，冰乙酸調pH到4.5；體積分數為5％的乙酸銨甲醇溶液：量取5 mL乙酸銨緩沖溶液(5 mol/L)用甲醇定容至100 mL。

標準曲線配制

將1.0 μg/mL的混合標準儲備液和0.1 μg/mL的混合內標儲備液取出，于室溫平衡后用AP 300 全自動液體樣品處理工作站配成濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L的標準工作曲線。

實驗步驟

1.樣品制備

鮮活水產品

稱取5.0g已搗碎的樣品于50 mL離心管中，加入200 μL混合內標標準溶液(100 ppb)，加入11 mL乙腈，用AH 50全自動均質器以10000 r/min的速度勻漿提取30 s并洗滌刀頭, 4000 r/min離心5min，上清液轉移至25 mL試管中；殘渣加入乙腈后再提取一次，合并上清液至25 mL試管中，用乙睛定容至25.0 ml，搖勻備用。

2.樣品凈化

移取5.0 mL上述的樣品溶液加至已活化的中性氧化鋁柱，5mL乙腈洗滌樣品瓶，收集全部流出液，用EVA 80全自動氮吹濃縮儀在40 ℃條件下濃縮至約1 mL，用乙腈準確定容至1.0 mL，再加入1 mL乙酸銨溶液（5 mmol/L）震蕩混勻，經濾膜過濾后供液相色譜-質譜/質譜測定。具體的固相萃取方法見圖-2。

固相萃取條件

圖-2.Fotector Plus固相萃取方法

3.液質檢測條件

4.MRM參數

Ps: 孔雀石綠和結晶紫采用D5-MG內標，隱性結晶紫和隱性孔雀石綠采用D5-LMG內標。

結果與討論

為了驗證該方法的回收率，本實驗向鱸魚樣品(5 g)中加入上述4種化合物標準品(20 μL, 1 mg/L)和2種氘代孔雀石綠和氘代隱性孔雀石綠(200 μL, 0.1 mg/L)作為內標進行加標回收驗證(n=3)。數據如表-2所示：四種目標化合物的加標回收率均在90-110%之間，RSD值控制在6%以內。說明該方法能夠很好地運用于水產品樣品中孔雀石綠和結晶紫的檢測。

表-2. 鮮活水產品的加標回收率及RSD值(2 μg/kg)

總結

本文采用高效液相色譜-串聯質譜法進行定性和定量測定，前處理過程使用Fotector Plus高通量全自動固相萃取儀進行凈化，準確性和平行性均滿足實驗要求；從活化到上樣、洗脫一步到位，一天最多能夠處理180個樣品，操作方便快捷，效率高。

AP 300全自動液體樣品處理工作站能夠實現標準曲線制備、樣品添加和分液等液體樣品處理功能，無需人員值守，程序化運行有效避免人為誤差，提高精密性的同時極大地減輕工作量，保護實驗人員的身體健康。